|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Rezistence k antibiotikům udílená proteiny ARE podrodiny ABC proteinů
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Borčin, Kateřina (oponent)
Hlavním tématem této práce je ARE podrodina ABC transportérů. Důležitost proteinů této podrodiny spočívá v tom, že udělují rezistenci k několika skupinám klinicky důležitých antibiotik: makrolidům, linkosamidům, streptograminům a pleuromutilinům a to u významných patogenů jakým je např. Staphylococcus aureus. Na rozdíl od klasických ABC transportérů struktura ARE proteinů postrádá transmembránovou doménu (TMD) a prozatím nebyl nalezen ani interagující transmembránový protein. Z toho důvodu není jasný mechanismus udílení rezistence. V práci diskutujeme obě navrhované hypotézy mechanismu funkce těchto proteinů. První je aktivní efflux antibiotika ven z bakterie. Druhá hypotéza spočívá v uvolnění antibiotika z jeho vazebného místa, které je iniciované ARE proteiny, a jeho následná pasivní difuse ven z buňky. Klíčová slova: ABC proteiny, ARE proteiny, rezistence, MLS, Vga
|
|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Melter, Oto (oponent) ; Branny, Pavel (oponent)
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Mechanismus inducibilní genové exprese rezistenčního proteinu Vga(A)LC ze Staphylococcus haemolyticus
Novotná, Michaela ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Protein VgaA za stafylokoků patří do skupiny ARE ABCF proteinů, které udílejí rezistenci k antibiotikům vázajícím se na 50S ribozomální podjednotku mechanismem ochrany cílového místa. VgaA udílí rezistenci k linkosamidům, streptograminům A a pleuromutilinům a poskytuje tak tzv. LSAP rezistenční fenotyp. Exprese rezistenčních genů v nepřítomnosti antibiotika často snižuje fitness, proto je jejich exprese přísně kontrolována a spouštěna pouze v odpovědi na přítomnost antibiotika, ke kterému daný protein udílí rezistenci. V případě genu vgaA byla inducibilní exprese taktéž pozorována, její mechanismus však nebyl dosud objasněn. V rámci diplomové práce bylo ukázáno, že gen vgaALC ze Staphylococcus haemolyticus je regulován pomocí ribozomem zprostředkované atenuace. Tento mechanismus je založen na detekci inhibitorů translace prostřednictvím ribozomu překládajícího speciální regulační otevřený čtecí rámec (uORF), který je součástí atenuátoru lokalizovaného v 5' nepřekládané oblasti mRNA. Gen vgaALC je regulován na transkripční úrovni v odpovědi na LSAP antibiotika, přičemž antibiotická specificita indukce je ovlivňována nejen charakterem peptidu kódovaného uORF, ale také antibiotickou specificitou rezistenčního proteinu. Technikou fluorescenční mikroskopie bylo ukázáno, že protein kontrolovaný...
|
|
|
Molekulární analýza rezistenčního genu vga(A)LC - identifikace klíčových aminokyselinových zbytků.
Kroová, Michaela ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Protein Vga(A) udílí stafylokokům rezistenci ke streptograminům A. Nedávno objevený protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) liší jen 7 aminokyselinovými zbytky, nicméně tato diference je dostačující k posunu jeho substrátové specifity směrem k linkosamidům. Čtveřice těchto aminokyselin v centrální části proteinu (LGAG u Vga(A) a SVTS u Vga(A)LC) byla detekována jako rozhodující pro určení substrátové specifity. V rámci této diplomové práce bylo v genu vga(A)LC navrženo 5 variant bodových mutací za účelem zjištění podílu jednotlivých aminokyselin z výše zmíněné čtveřice na určení substrátové specifity proteinu. Mutace byly připraveny ve vektoru pGEM® -T a klonovány do kyvadlového vektoru pRB374. Připravené konstrukty byly elektroporací transformovány do citlivého kmene Staphylococcus aureus RN4220 a agarovou diluční metodou byly stanoveny hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro linkomycin, klindamycin a pristinamycin IIA. U jedné z mutací nebyla transformace úspěšná. Výsledky stanovení MIC pro čtyři zbylé mutace neumožňují jednoznačně stanovit podíl jednotlivých aminokyselin na určení substrátové specifity. Bylo zjištěno, že dvě aminokyseliny jsou důležité. Předpokládáme přípravu dalších mutací.
|
|
|
Rezistence k antibiotikům udílená proteiny ARE podrodiny ABC proteinů
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Borčin, Kateřina (oponent)
Hlavním tématem této práce je ARE podrodina ABC transportérů. Důležitost proteinů této podrodiny spočívá v tom, že udělují rezistenci k několika skupinám klinicky důležitých antibiotik: makrolidům, linkosamidům, streptograminům a pleuromutilinům a to u významných patogenů jakým je např. Staphylococcus aureus. Na rozdíl od klasických ABC transportérů struktura ARE proteinů postrádá transmembránovou doménu (TMD) a prozatím nebyl nalezen ani interagující transmembránový protein. Z toho důvodu není jasný mechanismus udílení rezistence. V práci diskutujeme obě navrhované hypotézy mechanismu funkce těchto proteinů. První je aktivní efflux antibiotika ven z bakterie. Druhá hypotéza spočívá v uvolnění antibiotika z jeho vazebného místa, které je iniciované ARE proteiny, a jeho následná pasivní difuse ven z buňky. Klíčová slova: ABC proteiny, ARE proteiny, rezistence, MLS, Vga
|
host ::
RSS.